Como ya sabes, el conjugado consta de dos partes unidas covalentemente, una parte inmunorreactiva que puede ser un antígeno o un anticuerpo, y un enzima que catalizará la reacción de un sustrato, la cual facilitará la visualización de la reacción que ha tenido lugar en la fase sólida.

Los enzimas más utilizados son:

• La peroxidasa de rábano (HRP), que se obtiene fácilmente y también se conjuga fácilmente con diferentes anticuerpos y antígenos. La principal desventaja es que es incompatible con muchos conservantes , como por ejemplo la azida sódica, que se utilizan para reducir la contaminación microbiana en muchas soluciones tampón.
• La fosfatasa alcalina, procedente de intestino de ternera. Es más cara que la peroxidasa pero más estable aunque se conjuga peor con antígenos o anticuerpos que la anterior y tiene mayor impedimento estérico lo cual también supone una desventaja frente a  la HRP.

Para todas las técnicas de ELISA, la etapa final para visualizar la reacción antígeno-anticuerpo, es la adición de un sustrato cromogénico que en presencia del enzima dará lugar a un producto soluble coloreado que se valora con un espectrofotómetro o con un lector de microplacas de ELISA que, como puedes ver en la imagen es un espectrofotómetro adaptado para la lectura de absorbancias en placas de ELISA. La intensidad de color es proporcional a la cantidad de conjugado enzimático presente.

Para algunos cromógenos, la reacción es progresiva y para detener el desarrollo del color, se suele frenar la reacción cuando el estándar más concentrado tiene una absorbancia determinada. El frenado puede conllevar un cambio de color y, por tanto, de longitud de onda de absorción.

Los cromógenos para la peroxidasa, cuando se oxidan, originan productos coloreados. Los más utilizados son:

• OPD.Su oxidación da un producto de color amarillo que se lee a 450 nm. Cuando se detiene la reacción de oxidación con un ácido se obtiene un producto de color naranja que se lee a 492 nm.
• TMB. Durante la reacción de oxidación produce un color azul que se lee a 370 nm o a 650 nm, y, tal como se observa en la imagen, cuando se bloquea con un ácido se obtiene un producto de color amarillo que se lee a 450 nm.
• ABTS. El producto de reacción es verde-azulado y se lee entre 405 y 410 nm. La reacción se para con SDS, pero no cambia el color del producto.

Los cromógenos para la fosfatasa alcalina, cuando se hidrolizan originan productos coloreados. Los más utilizados son:

• p-NPP. Da lugar a p-nitrofenol amarillo.
• BCIP/NBT. El NBT actúa como oxidante mientras que el BCIP funciona como sustrato de la fosfatasa alcalina. El producto de reacción es azul oscuro.