Recuerda cómo funcionan los métodos competitivos que ya has estudiado en apartados anteriores. Cuando se aplican a técnicas con marcadores radiactivos surgen los radioinmunoensayos propiamente dichos (RIA). En ellos, la muestra con el antígeno a determinar se incuba con un anticuerpo específico y un antígeno marcado con un radioisótopo que se añaden a la vez.
La técnica se basa en la competición entre el antígeno problema (antígeno frío) y un antígeno marcado (antígeno caliente) a una concentración constante, para unirse a un anticuerpo añadido en concentración limitante, tal como puedes observar en el esquema que muestra la imagen.
La cantidad de anticuerpo es inferior a la que sería necesaria pera reaccionar con todo el analito, de forma que todo el anticuerpo reacciona con el antígeno frío y con el caliente. Como las concentraciones de antígeno marcado y de anticuerpos son constantes, la radiactividad que se mide corresponde al inmunocomplejo radioactivo y sólo dependerá de una única variable que es la concentración de analito. Cuanto más antígeno haya en la muestra, más inmunocomplejo sin marcar y menos inmunocomplejo marcado habrá, por lo tanto a menor radiactividad más antígeno abrá en la muestra.
La radiactividad total es la misma antes y después de la reacción, por lo tanto hay que separar la fase ligada (inmunocomplejos marcados y no marcados) de la no ligada (el resto de componentes). La radiactividad ligada B se puede medir directamente como cpm pero en general se mide el % respecto a la radiactividad total:
- Hay un control sin muestra donde la radiactividad será máxima porque todos los sitios de unión del anticuerpo se unen al antígeno marcado. El valor de esta radiactividad es el ligado máximo B0.
- La radiactividad ligada se suele expresar como % B/B0.
La radiactividad de la fracción ligada es inversamente proporcional a la concentración del analito en la muestra y debe compararse, mediante una curva de calibración, con la de los estándares para poder determinar el valor de la concentración de analito.
Para la realización de este calibrado, los estándares contienen una cantidad fija de anticuerpo y antígeno marcado, y una cantidad variable de antígeno problema. Con ellos se puede construir una curva de calibración radiactividad ligada-concentración que, como puedes ver en la imagen, no es lineal.
La separación de fases se suele realizar mediante una fase sólida, generalmente tubos de plástico o microplacas.