En el apartado de ELISA indirecto y en el de las técnicas avidina-biotina ya estudiaste cómo aumenta la sensibilidad cuando se amplifica la señal. En los inmunoensayos TRFIA, las moléculas fluorescentes utilizadas y una técnica especial de medida de fluorescencia, consiguen el mismo objetivo.
Las moléculas fluorescentes son quelatos de un metal lantánido, generalmente del ión europio Eu3+. El tiempo de fluorescencia de estos quelatos es mucho mayor que el de los fluorocromos tradicionales, y puede llegar a exceder los 1000 μs.
Se utilizan fluorímetros especiales en los que los quelatos se excitan unas 1000 veces por segundo a 340 nm. Como puedes ver en el diagrama, en cada ciclo se mide la emisión de fluorescencia después de un corto tiempo de latencia (unos 400 μs) para evitar la fluorescencia inespecífica (ruido de fondo) que suele durar unos 10 ns.
La suma de las medidas repetidas permite llegar a límites de detección muy bajos. El sistema es muy versátil y se puede utilizar en diferentes tipos de técnicas. Una de las más utilizadas es el DELFIA. En la imagen puedes ver un esquema de la técnica aplicada a la determinación de un antígeno (analito).
En los ensayos DELFIA, la molécula marcada prácticamente no muestra fluorescencia, pero cuando se añade una solución intensificadora después de producirse la reacción antígeno-anticuerpo, se desarrolla más fluorescencia. En pocos minutos, su bajo pH disocia el europio del compuesto marcado y rápidamente, junto con componentes de la solución intensificadora, forma un nuevo quelato altamente fluorescente dentro de una micela protectora. La solución intensificadora amplifica la fluorescencia del quelato hasta diez millones de veces y esa fluorescencia es proporcional a la concentración del antígeno, es decir, del analito que se quiere determinar.
Los inmunoensayos de fluorescencia DELFIA se realizan en microplacas preparadas y su principal característica es su elevada sensibilidad. Todo el manejo de muestras y reactivos, así como todas las etapas del ensayo pueden realizarse en un sistema de inmunoensayo automático.
El sistema completo, que puedes ver en la imagen, consta de un procesador de muestras que realiza la dilución automática y el pipeteo de muestras de suero, y un procesador de microplacas que lleva a cabo el manejo de reactivos y todas las fases del ensayo, incluyendo la medición.
Los quelatos son complejos formados por la unión de un metal y un compuesto que contiene dos o más ligandos potenciales
Grupo de elementos químicos cuyo número atómico está comprendido entre el 57 y el 71, ambos incluidos; son metales, como el lantano
El europio es un elemento químico de la tabla periódica cuyo símbolo es Eu y su número atómico es 63, forma parte de la serie química de los lantánidos.
Equipo que permite el análisis, la identificación y la cuantificación de sustancias químicas con moléculas susceptibles de presentar fluorescencia
En disoluciones acuosas las moléculas anfifílicas forman micelas en las que los grupos polares están en la superficie y las partes apolares quedan inmersas en el interior de la micela en una disposición que elimina los contactos desfavorables entre el agua y las zonas hidrófobas y permite la solvatación de los grupos de las cadenas polares
Separar los distintos componentes de una sustancia. Separar una cosa de otra a la que estaba unida.
Los quelatos son complejos formados por la unión de un metal y un compuesto que contiene dos o más ligandos potenciales
Grupo de elementos químicos cuyo número atómico está comprendido entre el 57 y el 71, ambos incluidos; son metales, como el lantano