En este apartado vas a estudiar aquellos inmunoensayos en los que la detección se efectúa mediante la intervención de una sustancia fluorescente. Todos se basan en el fenómeno de la fluorescencia. En algunos casos el marcador es una molécula fluorescente mientras que en otros el marcador es un enzima que cuando actúa sobre ciertos sustratos genera fluorescencia. Los primeros son verdaderamente fluoroinmunoensayos mientras que los segundos, de hecho, son fluoroenzimoinmunoensayos.
Las moléculas fluorescentes (fluorocromos) son capaces de absorber energía en forma de radiación luminosa y emitirla en forma de radiación luminosa de menor energía y mayor longitud de onda. La luz absorbida excita los electrones de la molécula desde su estado fundamental a un estado excitado pero las moléculas excitadas son poco estables y rápidamente pierden energía para volver a su estado fundamental. El retorno al estado fundamental emitiendo radiación luminosa constituye la fluorescencia.
En la fluorescencia, la radiación de emisión siempre tiene una longitud de onda mayor que la de excitación. Esta diferencia entre las dos longitudes de onda se denomina desplazamiento de Stokes.
Estos inmunoensayos se basan en la medida de la fluorescencia, es decir, de la radiación luminosa emitida por un fluorocromo cuando es excitado por una determinada longitud de onda.
Los fluoroinmunoensayos tradicionales eran poco sensibles por el elevado ruido de fondo o background de las medidas de fluorescencia pero actualmente hay técnicas basadas en la detección de fluorescencia que son tan sensibles como las que utilizan otros tipos de detección porque se han desarrollado nuevos marcadores fluorescentes y porque se han mejorado los instrumentos de medida.
Los marcadores utilizados en estas técnicas pueden ser fluorocromos, como la fluoresceína, o bien fluorógenos, sustratos que se convierten en productos fluorescentes por acción de algún enzima, como por ejemplo ciertos compuestos de umbeliferona.