2.16.- Inmunoensayos quimioluminiscentes.

En este apartado vas a estudiar aquellos inmunoensayos en los que la detección del inmunocomplejo se efectúa mediante la intervención de una sustancia quimioluminiscente.

La quimioluminiscencia se podría definir como la producción química de luz visible. Los marcadores quimioluminiscentes emiten luz como resultado de una reacción química en la que uno de los productos intermedios se excita y vuelve al estado fundamental emitiendo luz. En la actualidad los más utilizados para esta técnica son, por ejemplo, el luminol y sus derivados( isoluminol , pirogalol), y los esteres de acridina que se conjugan con el Antígeno o Anticuerpo en presencia de compuestos oxidantes tiene lugar la emisión de luz a partir del producto excitado por la oxidación.

Cuando las reacciones quimioluminiscentes se producen en sistemas biológicos, como es el caso de las luciérnagas , el proceso se denomina bioluminiscencia. Las sustancias bioluminiscentes son derivados de la luciferina ( molécula procedente de la luciérnaga) que se oxidan en presencia de un enzima específica, la luciferasa y emiten luz.

 

Muchas de las reacciones de quimioluminiscencia son de tipo oxidativo y tienen lugar en presencia de oxígeno o peróxido de hidrógeno (H2O2) y un enzima. Uno de los sustratos más utilizado en estas técnicas es el luminol.

En las técnicas de quimioluminiscencia, las emisiones luminosas pueden ser de dos tipos: flash o glow.

• Quimioluminiscencia flash: La adición de los reactivos provoca la emisión inmediata de luz. La señal luminosa es similar a un flash que llega a su máxima intensidad en segundos o milisegundos. Debido a la gran rapidez de la reacción, la mezcla de los reactivos debe ser instantánea: debe hacerse en la posición de la lectura, frente al sistema de detección, para poder registrar la emisión de luz. La quimiluminiscencia de los esteres de acridina es de tipo flash.
• Quimioluminiscencia glow: Es una emisión prolongada de luz intensa, que llega al máximo después de un tiempo de incubación. La luz emitida aumenta poco a poco detectándose en forma de pico de larga duración. Estas reacciones son estables durante un mínimo de 20 minutos. La reacción se puede iniciar fuera del aparato de detección, el procedimiento es más sencillo y más sensible que las técnicas flash. La quimioluminiscencia del luminol es de tipo glow.

El esquema de las técnicas se asemeja al de otros inmunoensayos que ya has estudiado, así por ejemplo se pueden realizar técnicas sándwich utilizando un anticuerpo de captura unido a una fase sólida y otro anticuerpo secundario marcado, ambos dirigidos contra el analito que se pretende detectar.

Todas las técnicas se basan en el fenómeno de la quimioluminiscencia pero en algunas, el marcador es una molécula quimioluminiscente mientras que en otras, el marcador es un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina o beta-galactosidasa) que cuando actúa sobre ciertos sustratos genera quimioluminiscencia. Estas últimas, de hecho, son un tipo de enzimoinmunoensayos porque el inmunorreactivo está marcado con un enzima, pero generalmente se utiliza el término inmunoensayos quimioluminiscentes para referirse a todos ellos.

Para el cálculo de la concentración de analito se compara su luminiscencia con la de un estándar de concentración conocida. La emisión quimioluminiscente se mide en RLUs, para ello se utilizan espectrómetros de quimioluminiscencia molecular, también llamados luminómetros.