En este apartado estudiarás otro método de detección de proteínas separadas por electroforesis mediante su unión a anticuerpos específicos. La particularidad de esta técnica es que se basa en la transferencia de las proteínas separadas, desde el soporte de la electroforesis a una membrana, generalmente de nitrocelulosa.

La técnica consta de las siguientes fases:

1. Electroforesis de una mezcla de antígenos para separar los componentes por diferencias de carga y peso.
2. Transferencia. Se realiza recubriendo el soporte con una hoja de papel de nitrocelulosa, las proteínas se transfieren del soporte a la membrana de nitrocelulosa en la misma posición y se unen a ella de forma irreversible. La transferencia se puede hacer de dos formas:
   • Por electroforesis, aprovechando las cargas negativas de las proteínas. El electrodo negativo se encuentra bajo el soporte y el positivo sobre la nitrocelulosa.
   • Por capilaridad, a través de un flujo de solución amortiguadora desde unos papeles de filtro húmedos situados bajo el gel a otros secos que se hallan sobre la nitrocelulosa.
3. Bloqueo. Como ya se ha dicho, las proteínas se unen a la nitrocelulosa de forma irreversible, por tanto se debe evitar la unión de los anticuerpos que se utilizan posteriormente a los lugares de la nitrocelulosa que aún no contienen moléculas de proteína unidas. Para ello la nitrocelulosa se trata con soluciones de bloqueo similares a las utilizadas en técnicas de ELISA, es decir, soluciones de proteínas y detergentes que se unen todos los sitios de unión que quedan para minimizar las uniones inespecíficas en la fase siguiente.
4. Incubación con anticuerpo específico. Cuando se añade el anticuerpo, sólo hay lugar en la membrana para que se una a las proteínas que han sido separadas por electroforesis (antígenos). Esto reduce el ruido de fondo en el producto final, lo que conduce a resultados más claros y elimina los falsos positivos. El exceso de anticuerpo se elimina por lavado.
5. Incubación con una anti-Ig marcada. El exceso de anti-Ig se elimina por lavado.
6. Visualización de los resultados a través de diferentes técnicas según el marcador utilizado: revelado enzimático, autorradiografía (para conjugados radiactivos), detección de quimioluminiscencia o detección de fluorescencia.

El Western blot se puede utilizar para detectar anticuerpos anti-VIH en muestras de suero humano. Para ello, proteínas de células infectadas por el VIH se separan y se transfirieren a una membrana y después, en la etapa de incubación con anticuerpo primario, se aplica el suero del paciente. En la imagen se ven los resultados de tests diferentes. El primer canal de la izquierda es un control negativo y el segundo, un control positivo. Los canales del 3 al 10 muestran los cambios en una persona infectada, el 3 corresponde al primer día de la infección y el 10 se considera como concluyente de infección por VIH. Cada banda indica la presencia de anticuerpos anti-VIH en el suero del paciente.

Esta técnica se utiliza también como prueba definitiva para la encefalopatía espongiforme bovina, conocida comúnmente como "enfermedad de las vacas locas". También se puede utilizar como una prueba de confirmación de infección por el virus de la hepatitis B.