2.4.- Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA).

Componentes de un kit comercial de ELISA.

En el laboratorio clínico, la mayor parte de inmunoensayos realizados son heterogéneos. Muchos de ellos utilizan enzimas como marcadores pues, como ya sabes, aceleran reacciones y si el sustrato es el adecuado pueden generar rápidamente un producto coloreado que permitirá el seguimiento de la molécula marcada con el enzima. El ELISA ( Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay) es un tipo de enzimoinmunoensayo, es decir un inmunoensayo heterogéneo que utiliza enzimas como marcadores.

Este tipo de técnicas constan de tres pasos principales:

  1. Reacción entre el antígeno y el anticuerpo específico. Uno de los dos componentes de la reacción está marcado con un enzima, por tanto también lo estará el inmunocomplejo formado.
  2. Revelado, es decir la adición de un sustrato específico del enzima (cromógeno) que generará un producto coloreado.
  3. Lectura por espectrofotometría del producto final coloreado y cálculo de la concentración del analito a partir de los datos obtenidos.

El ELISA es el enzimoinmunoensayo más utilizado. Se desarrolló en 1971 y desde entonces se ha ido perfeccionando y diversificando hasta detectar multitud de antígenos y anticuerpos.

Como en todos los inmunoensayos heterogéneos, para medir el inmunocomplejo marcado hay que separarlo de los otros reactivos. La separación puede efectuarse porque en el transcurso de la técnica los inmunocomplejos, con el antígeno o el anticuerpo marcados con el enzima, quedarán unidos a una fase sólida a la que denominamos soporte que ha de ser inmunoadsorbente.

Las fases sólidas utilizadas se caracterizan por su capacidad para fijar proteínas y pueden ser de diferentes tipos. Las más utilizadas son las microplacas de 96 pocillos, con un volumen aproximado de 300 μL por pocillo, porque son especialmente ventajosas para procesar un elevado número de muestras. Como se puede comprobar en esta imagen, los kits comerciales utilizados en el laboratorio clínico suelen emplear microplacas de material plástico, ya sea polivinilo (PVC) o poliestireno. Este tipo de soportes, ya preparados, contienen antígenos o anticuerpos previamente adsorbidos por sensibilización

Es el acrónimo en inglés de :contains different kinds of tool( contiene diferentes clases de herramientas/reactivos)

Recuerda que el término sensibilización también se utiliza en técnicas de aglutinación para designar a la unión artificial de antígenos a la superficie de partículas y elementos celulares, y para designar una de las fases de la propia aglutinación.

Soportes sólidos utilizados en ELISA.
Material del soporte Formas disponibles
Nitrocelulosa Membranas, láminas
Polivinilo (PVC) Microplacas, láminas
Poliestireno Microplacas, láminas, perlas
Látex, nailon y celulosa Membranas, láminas, perlas

La nitrocelulosa es un compuesto sintético obtenido a partir de la celulosa. Visualmente puede tomar una forma muy similar al algodón, casi indistinguible, pero sus propiedades son muy diferentes, lo que permite formar con ella membranas o láminas de soporte para reacciones bioquímicas

esferas de poliestireno

Fibra sintética, elástica y resistente, que se utiliza para fabricar hilos y tejidos

El ELISA directo es el diseño de ELISA más sencillo para determinar un analito, pero no se suele utilizar como método de rutina en diagnóstico clínico porque precisa de la sensibilización de las microplacas con la muestra problema, por ejemplo el suero de un paciente, proceso que necesita de largos períodos de incubación y de concentraciones elevadas de analito en la muestra.