En la realización de cualquier técnica de ELISA hay una serie de pasos que siempre se repiten, de forma que se puede hablar de una metodología general que, básicamente, afecta tres fases de un ELISA:

1. Tapizado de los pocillos con el antígeno o anticuerpo en la microplaca de poliestireno  que es lo que habitualmente se utiliza
2. Bloqueo de los sitios activos no saturados.
3. Etapas de lavado.
4. Reacción con el conjugado enzimático.

En este apartado estudiarás el tapizado de los pocillos y el bloqueo de los sitios activos no saturados y en los siguientes, las etapas de lavado y la reacción con el conjugado enzimático.

El tapizado de los pocillos se realiza básicamente mediante dos métodos :

- Dilución del antígeno o Anticuerpo en tampón carbonato (pH 9,6) e incubación posteriordurante 3h a 37º o 16h a 4ºC.

- Tratamiento a 40º-50ºC en tampón fosfato PBS o solución salina fisiológica tamponada,a pH entre 7,2 y 7,4 hasta desecación.

Hay que tener en cuenta que este primer paso de tapizado muchas veces se ahorra ya que las casa comerciales tiene los kits preparados ya con las placas recubiertas de antígeno o anticuerpo.

El bloqueo de los sitios activos no saturados se realiza porque los inmunoensayos en fase sólida, como el ELISA, implican la inmovilización de ciertas proteínas a la superficie de la fase sólida (sensibilización). Como a lo largo de la técnica existe el riesgo de que algunas moléculas de las soluciones de inmunorreactivo también puedan unirse inespecíficamente a puntos no ocupados de la fase sólida influyendo en la especificidad y en la sensibilidad de los resultados, se realizará el bloqueo para que estas uniones inespecíficas se puedan minimizar , saturando los sitios no ocupados con un reactivo bloqueante que no intervenga de activamente en las reacciones del inmunoensayo.

Los agentes bloqueantes generalmente se escogen de forma empírica ya que no hay ningún procedimiento estandarizado que sea útil para todas las técnicas. Se suelen utilizar proteínas inertes y detergentes no iónicos.

Las proteínas son bloqueantes permanentes. Se suele utilizar albúmina bovina sérica (BSA), leche en polvo descremada (por su contenido en lactoalbúmina y caseína) o gelatina.

Los detergentes no iónicos inestabilizan interacciones de tipo iónico o hidrofóbico entre la superficie de la fase sólida y las biomoléculas. A diferencia de las proteínas, son agentes bloqueantes temporales, no impiden la unión de biomoléculas a la superficie de forma permanente porque son eliminados en las fases de lavado, por eso deben estar presentes en todas las fases de lavado. Lo mejor es utilizarlos junto con otros bloqueantes proteicos. El detergente no iónico más utilizado es el polisorbato (Tween).