En apartados anteriores ya has estudiado cómo en los inmunoensayos heterogéneos, independientemente de que el antígeno o el anticuerpo estén unidos a la superficie, se requiere una etapa de separación física para eliminar las fracciones libres (exceso de inmunorreactivos marcados). Esta etapa se denomina lavado y también permite eliminar el exceso de analito así como las demás moléculas presentes en la muestra.

Las técnicas de ELISA se realizan mediante la adición secuencial de todos los reactivos necesarios separados por estas etapas de lavado. En el caso de microplacas, el lavado se lleva a cabo llenando consecutivamente los pocillos con solución de lavado para seguidamente vaciarlos por decantación o aspiración.

Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas, preferiblemente de tipo multicanal o con equipamiento para su automatización, lo que permite procesar y analizar un gran número de muestras.

Para ello:

• La solución de lavado debe ser un tampón fisiológico que no interfiera con la actividad inmunológica y enzimática, y debe contener detergente para ayudar en la eliminación de la proteína no unida.
• El volumen de solución de lavado dispensado en cada pocillo ha de ser el necesario para cubrir totalmente la superficie recubierta con antígeno o anticuerpo. Se debe añadir un volumen igual de solución de lavado en cada pocillo, suavemente y con la misma fuerza para evitar la extracción de las proteínas unidas
• Los pocillos deben ser lavados entre tres y cinco veces.
• El mejor método para la eliminación de la solución de lavado es la decantación manual, pero también puede utilizarse la aspiración que debe controlarse para evitar que la superficie se seque.
• Por último, la superficie de los pocillos se debe mantener húmeda en todo momento. Cuando se manipulan varias placas, se deben mantener los pocillos llenos de solución de lavado hasta que se pueda proceder con el siguiente paso o bien dejar las microplacas invertidas sobre papel de celulosa humedecido para así mantener hidratada la superficie en caso de que la técnica se prolongue excesivamente.