La electroforesis es una técnica muy utilizada en la separación e identificación de un gran número de proteínas. En este caso, su aplicación se centrará en la separación de los distintos tipos de hemoglobinas, pero los principios generales son muy parecidos en cualquier electroforesis de proteínas.

En la electroforesis de hemoglobina se realiza un hemolizado de la muestra de sangre que se deposita sobre un soporte adecuado. Dicho soporte está empapado en un líquido de pH conocido y controlado. Tras la colocación de la muestra se aplica una corriente eléctrica que lo atraviesa. Las cadenas polipeptídicas de la globina, dependiendo del pH del medio adquieren una carga eléctrica determinada, en medio básico adquieren carga negativa, de modo que la hemoglobina migra desplazándose progresivamente hacia el ánodo.

En la sangre hay varios tipos de hemoglobinas y cada una de ellas adquiere la carga eléctrica de una forma más ó menos intensa. La más electronegativa avanza más rápidamente al ánodo y las menos electronegativas lo hacen más lentamente. Al cabo de cierto tiempo, las moléculas de hemoglobina idénticas se agrupan entre sí y adoptan el aspecto de bandas tal como se observa en la imagen.

Cada banda está constituida por un tipo diferente de hemoglobina y se separa del resto debido a su distinta carga eléctrica y por consiguiente a su diferente capacidad de migración.

Los soportes más utilizados son los siguientes:

• Acetato de celulosa (pH = 8'6). Separa Hb A, Hb A₂, y Hb F.
• Gel de agar (pH = 6). Determinados tipos de hemoglobinas (A₂, C, E, S y D) debido a que poseen una intensidad de carga similar, migran prácticamente al mismo nivel cuando se separan en soporte de acetato de celulosa a pH = 8'6. En estos casos, para conseguir una mejor separación entre dichas fracciones, se emplea "Gel de agar" como soporte y un pH = 6. Separa Hb S de la Hb D y Hb C de la Hb E.