3.7.4. Otras pruebas para la determinación de hemoglobinas.

Existen otras técnicas que se han adaptado a la identificación y cuantificación de los distintos tipos de hemoglobinas. Entre ellas destacan distintas variantes de cromatografía. Sin duda alguna, la cromatografía líquida de alta resolución es la técnica de referencia gracias a sus magníficas capacidades para identificar y cuantificar las diferentes hemoglobinas así como su idoneidad para la integración en rutinas automatizadas. Como inconveniente, la cromatografía líquida de alta resolución, tiene el elevado coste de los equipos y un delicado mantenimiento de los mismos, por lo que hay otras técnicas disponibles, para ciertas determinaciones, que es necesario conocer ya que también son alternativas válidas.

Se ve una columna de microcromatografía consistente en un tubo de plástico que se estrecha en su parte inferior que esta ocupada por una sustancia, resina, blanca. El tubo termina en una pestaña que sella el final del mismo.

  • Cuantificación de Hemoglobina A2.

Se determina mediante cromatografía de microcolumnas, cromatografía líquida de alta resolución o bien mediante cuantificación de la banda electroforética obtenida. La Hb A2, cuyos valores normales están entre el 2 y el 3 %, esta aumentada en β Talasemia con valores que están entre el 3,8 y el 7 %.

  • Determinación de Hemoglobina F.

En condiciones normales prácticamente no existe Hb F (menos del 1 %). Sin embargo, la Hemoglobina Fetal esta aumentada en la β-Talasemia y en embarazadas, con hematíes del feto en su torrente circulatorio como consecuencia de una hemorragia transplacentaria. Se puede determinar mediante varias técnicas:

  • Determinación mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Determina Hb A2, Hb F, Hb S.

Gráfica obtenida por HPLC

  • Método de la resistencia a la elución ácida de kleihauer.

La prueba de Kleihauer se usa para determinar si hay glóbulos rojos del feto en una mujer embarazada. En este test una muestra de sangre materna se trata con un tampón ácido que elimina toda la hemoglobina presente en la muestra excepto la Hb F. Una tinción posterior específica para hemoglobina hace aparecer de color rosa a los glóbulos rojos que contienen Hb F.

En la imagen se observa el resultado de una prueba de Kleihauer, los hematíes más intensamente coloreados corresponden a hematíes fetales, por tanto con Hb F.

Imagen en la que se muestra un campo microscópico con numerosos hematíes teñidos, algunos poseen una mayor intensidad de color.

Extracción de una sustancia absorbida desde un lecho poroso o columna de cromatografía mediante disolventes adecuados.

Para terminar, los contenidos sobre la determinación de los distintos tipos de hemoglobinas se tienen una serie de pruebas de ejecución simple.
  • Pruebas de estabilidad.

Sirven para poner de manifiesto la existencia de hemoglobinas patológicas que se caracterizan por desnaturalizarse en ciertas condiciones en las que las hemoglobinas normales son estables.

  • Prueba de estabilidad al calor. Consiste en incubar la sangre a 50 ºC y observar la presencia de precipitados
  • Prueba de estabilidad en isopropanol. Consiste en incubar la sangre con isopropanol y observar la presencia de precipitados.
  • Prueba de falciformación.
  • Consiste en someter a los hematíes a condiciones anaerobias, incubando la muestra de sangre con metabisulfito, y posteriormente realizar una extensión. La observación de células falciformes indica que el paciente es portador de Hb S.
  • Detección de cuerpos de Heinz.

Los cuerpos de Heinz son partículas de hemoglobina desnaturalizada que tienen forma redondeada y de color azul intenso. La determinación se realiza incubando sangre anticoagulada con cristal violeta, realizando extensiones y observando los hematíes con cuerpos redondeados de color azul intenso (cuerpos de Heinz). Se pueden encontrar después de administrar drogas oxidantes en deficiencias enzimáticas, en presencia de hemoglobina inestables, en algunas talasemias y después de esplenectomías.

Autoevaluación

Rellena los huecos que faltan:
La cuantificación de la hemoglobina A2 se puede realizar mediante de microcolumnas, En el test de falciformación se someten a los hematíes a condiciones para forzar la aparición de hematíes que indican la presencia de hemoglobina

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