Imagina que al igual que Carlos y Susana tienes en tus manos una muestra o un cultivo y quieres saber cuántas bacterias contiene. ¿Por dónde empezarías? Quizá lo primero que se nos ocurriría sería mezclar bien la muestra y tomar una parte para sembrarla en una placa de medio de cultivo.

¿Qué cantidad tomarías? Un volumen alto, por ejemplo 1 ml nos plantearía problemas para distribuirlo homogéneamente por la placa, necesitamos que las colonias estén separadas para poder contarlas.

¿En qué medio o medios la sembrarías? Dependerá del tipo de bacterias que esperemos encontrar en la muestra. Si esperamos encontrar bacterias exigentes debería ser un medio enriquecido del tipo agar sangre. Si por el contrario las bacterias son de fácil crecimiento con un medio general como el agar nutritivo bastaría. En clínica se suele utilizar el agar CLED para sembrar muestras de orina.

Observa los diferentes tipos de colonias que crecen cuando se siembra una placa de CLED con una muestra de orina. La siembra en medios diferenciales permite realizar recuentos selectivos, de un tipo concreto de microorganismos. En este caso podríamos contar sólo las colonias amarillas o las incoloras según el tipo de bacteria que creyéramos que está causando la infección en el paciente.

En los laboratorios de microbiología existen varios procedimientos para realizar recuentos. Todos ellos tienen los siguientes pasos comunes:

• Homogenización de la muestra antes de tomar el inóculo.
• Selección del medio de cultivo apropiado.
• Incubación: De 18 a 24 horas
• Cálculo del número de colonias en UFC/ml.

Varían en el procedimiento de siembra empleado:

1. Algunos métodos emplean asas calibradas que transfieren volúmenes de 1 y 10 µl. Este inóculo se distribuye uniformemente en la placa realizando un césped a partir de una estría central y girando la placa
   
   90º varias veces para hacer estrías perpendiculares a la estría inicial. En algunos laboratorios se utiliza un método alternativo, el establecido por Kaas que consiste en realizar solo la inoculación inicial y la primera estría perpendicular.
2. Cuando el volumen que se quiere sembrar es mayor, de alrededor de 100 μl, se puede realizar una siembra en superficie utilizando el asa de Digralsky.
3. Existe también la posibilidad de sembrar volúmenes de 1 ml. En este caso se utiliza el procedimiento de siembra por vertido en placa. Se mezclaría el ml de muestra con agar fundido a 45 ºC en una placa, se homogenizaría y se esperaría a que solidificase. En este caso algunas de las colonias crecerían en el interior del agar. Observa cómo han crecido han crecido las colonias en esta placa sembrada mediante el procedimiento de siembra por vertido. Algunas han crecido en la superficie del agar y presentan una forma redondeada, otras han crecido en su interior y tienen forma alargada.

Cálculo del número de colonias: Se realiza una vez transcurrido el proceso de incubación y consiste en contar las colonias aisladas obtenidas en las placas. Una vez contadas las colonias que hay en el volumen sembrado, se harán los cálculos para dar los datos en UFC/ml.

Aunque no se utiliza en clínica, cuando el número de bacterias de la muestra o del cultivo se sospecha que es alto, se deben realizar diluciones decimales sucesivas de la muestra previamente a su inoculación. Por ejemplo se diluye 1 ml de la muestra en 9 ml de un medio diluyente. Se pueden realizar tantas diluciones decimales como se crea conveniente. Cada una de ellas se sembrará en una placa. Tras la incubación el cálculo se realizará en aquella placa que tenga un número de colonias entre 30 y 300. Los resultados de las bacterias contadas corresponderán a la dilución sembrada por lo que para saber el número de bacterias presentes en la muestra será necesario multiplicar ese número por la inversa de la dilución realizada.