¿Cuáles son las condiciones de trabajo en el laboratorio de Biología Molecular?
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la técnica más importante en el laboratorio de Biología Molecular. Una de las grandes ventajas de la PCR es su exquisita sensibilidad. En ella, se pueden sintetizar millones de copias de moléculas de ADN a partir de unas pocas copias de la secuencia objetivo después de solo unos ciclos de amplificación. La sensibilidad de la PCR, permite a los científicos extraer y amplificar el ADN de muestras con muy poca cantidad de ácido nucleico de partida. Si bien este hecho constituye una ventaja para el investigador, también puede crear problemas si no se tiene cuidado para evitar la contaminación con otras fuentes de material genético presentes en el entorno del laboratorio. Estos problemas de contaminación pueden dar como resultado que se amplifique la secuencia incorrecta. A diferencia de lo que ocurría con el Laboratorio de Citogenética, donde el mayor riesgo de contaminación era por microorganismos, en este laboratorio el mayor riesgo lo supone la contaminación por ADN distinto al ADN de interés. Por ello, tanto las condiciones de trabajo, como la distribución de las diferentes áreas, deben estar encaminadas a evitar dicha contaminación.
La estructura del laboratorio de Biología Molecular, está por tanto condicionada por la técnica de PCR. Esta técnica implica:
- Extracción y purificación de los ácidos nucleicos
- Preparación de reactivos
- Reacción de amplificación
- Análisis de los productos de reacción
Cada una de estas actividades deberá ser desarrollada en áreas de trabajo independientes, físicamente separadas, donde cada una cuente con su propio instrumental como puede ser vórtex, centrífugas, pipetas, tips, etc. Es decir, muchos de los materiales deberán estar duplicados para evitar posibles contaminaciones. Cabe destacar que las puntas para micropipetas utilizadas en todas las áreas deben tener filtro para evitar la contaminación de las mismas por formación de aerosoles.
Asimismo, el flujo de trabajo deberá ser unidireccional, es decir, desde la zona de “pre-PCR” a la de"PCR" y de ahí a la de “post-PCR”. De manera que al realizar las actividades propias de un laboratorio de PCR se trabajará siempre desde el área más limpia hacia las áreas más sucias.
En el área de “pre-PCR” existirá una primera sala donde se realizará la preparación y el almacenamiento de reactivos. Para evitar contaminaciones, en esta zona no estará permitida la entrada de ADN, de manera que se considerará "área limpia" (libre de ADN). También existirá una sala de manipulación y preparación de muestras para la extracción, purificación y cuantificación de ácidos nucleicos y de almacenamiento de muestras y de extractos de ADN de uso cotidiano.
El área de "post-PCR", se dedicará a la manipulación y el análisis de productos de PCR (electroforesis, documentación de geles, cuantificación, secuenciación y análisis de fragmentos). Para prevenir problemas de contaminación, toda manipulación de productos de PCR se realiza solo en este laboratorio.
¿Cómo está organizado un laboratorio de Biología Molecular?.
Por tanto, en el laboratorio de Biología Molecular se pueden diferenciar las siguientes áreas de trabajo.
Sala de preparación de reactivos: El área de preparación de reactivos se define como aquella “área limpia” donde se utilizan protocolos y equipamientos para preparar las mezclas de reacción que serán utilizadas en la PCR. Todo el equipamiento utilizado, será exclusivo de esta área. Debe haber un congelador de -20°C de uso exclusivo para almacenar los reactivos y nunca se mezclará con material biológico (extractos de ADN o ARN, amplicones). Las batas y guantes utilizados en esta área deben ser exclusivos, por lo tanto, el personal que ingrese a esta sala deberá quitarse previamente los elementos de protección que esté utilizando, y vestir elementos de protección limpios una vez dentro. Este espacio debe contar con una cabina de bioseguridad de Clase II, cerrada que posea luz ultravioleta (UV). Dentro de esta cabina deben manipularse todos los reactivos para preparar las mezclas de PCR. En su interior deben mantenerse micropipetas, tubos y gradillas de uso diario. La cabina cerrada va a permitir irradiar la superficie de trabajo dentro de la cabina con luz ultravioleta previo a su uso, de forma que las pirimidinas de cualquier resto de ácido nucleico presente en la cabina formen dímeros entre sí (cross-link) bloqueando el paso de la polimerasa en una futura reacción de PCR.
Sala de procesamiento de muestras y extracción de ácidos nucleicos: El área de procesamiento de muestras debe estar separada del área de amplificación y detección así como del área preparación de reactivos. La extracción de ácidos nucleicos debe realizarse en una cabina de bioseguridad clase II, de forma que el personal que manipule muestras biológicas se mantenga protegido y, al mismo tiempo, se aísle el producto de posibles contaminaciones externas. Se considera "área sucia" por ser un área con presencia de ADN. Para mantener el flujo unidireccional de trabajo y evitar retroceder desde áreas sucias hacia áreas limpias, cada una de las áreas debe contar con recursos exclusivos tales como: agua libre de nucleasas, centrífugas, vórtex, refrigeradores/congeladores, micropipetas, puntas para micropipetas así como los kits de extracción de ácidos nucleicos y todo lo que sea necesario para la realización de la técnica. Se incluye además, elementos adicionales como ordenadores, rotuladores y calculadoras que deben ser exclusivos de cada área y no intercambiables. Asimismo, deberán mantenerse cantidades suficientes de guantes y batas, de forma que su uso sea exclusivo en este área y se disminuya al mínimo el riesgo de contaminación.
Área de Carga: Se considera "área sucia". En esta área deben añadirse la muestra de ADN molde a la mezcla de reacción que han sido preparadas en el área limpia. El personal deberá utilizar los elementos de protección exclusivos de esta área. Además, debe contar con cabina de seguridad biológica de clase II cerrada que posea luz ultravioleta, micropipetas, gradillas y microcentrífuga de uso exclusivo. Antes de abrir los tubos que contienen el ADN molde, debe realizarse una breve centrifugación (spin) para evitar el escape de aerosoles al abrir el tubo. Una vez añadido el ácido nucleico, los tubos se cerrarán herméticamente y se llevarán al área de amplificación.
Sala de PCR: Se considera "área sucia". Dispone de termocicladores para llevar a cabo la reacción de PCR.
Sala de Post-PCR: Dispondrá de equipos para la verificación de los resultados. Debe contar con equipos para realizar electroforesis, transiluminadores y documentadores de geles, que deberían situarse en una sala oscura dentro del laboratorio. La sala post-PCR, es una sala "sucia", fuente importante de contaminación por producto terminado o carryover.
Área de secuenciación: Incluye todos los aparatos necesarios para realizar el procedimiento de secuenciación automática de las muestras de ADN. Estos equipos los estudiarás con detalle en la unidad correspondiente. En la imagen puedes observar en primer plano el secuenciador.
Cámara fría: Estancia que se mantiene a una temperatura de 4 ºC utilizada para almacenamiento de muestras y reactivos y para la realización de procedimientos que necesiten ser realizados a baja temperatura, como las electroforesis de larga duración.
Las polimerasas son enzimas cuya función está relacionada con los procesos de replicación y transcripción de los ácidos nucleicos. Existen dos tipos fundamentales de estas enzimas: la ADN polimerasa y la ARN polimerasa. La ADN polimerasa es la encargada sintetizar la nueva cadena de ADN durante el proceso de replicación, adicionando nuevos nucleótidos. Son enzimas grandes, complejas, y difieren en su estructura dependiendo si se encuentra en un organismo eucariota o en uno procariota.
Compuestos orgánicos nitrogenados formado por un anillo hexagonal que contienen cuatro átomos de carbono y dos de nitrógeno. Forman parte de los nucleótidos, que a su vez son los constituyentes estructurales fundamentales de los ácidos nucleicos. Además de su presencia en los ácidos nucleicos, los nucleótidos formados por pirimidinas tienen un papel importante como mensajeros intracelulares y participan en la regulación de rutas de biosíntesis de glicógeno y fosfolípidos.
Fragmento de ADN amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o cualquier otro proceso que dé lugar a la producción de diferentes copias de ese fragmento.
Las nucleasas son enzimas que se encargan de degradar ácidos nucleicos. Esto lo logran por la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster que mantienen unidos a los nucleótidos. Estas enzimas aparecen en toda muestra biológica y juegan papeles fundamentales en la replicación, reparación del ADN.