2.1.- Tipos de cultivo celular.

¿Cuántas formas de cultivo celular existen?

Existen tres tipos principales de cultivos:

• Cultivo de órganos
• Cultivo de explantes
• Cultivo de células

Cultivo de órganos.

En este tipo de cultivo se mantiene la organización tridimensional del órgano in vivo, aunque sólo sea parcialmente. El órgano o porción del mismo se mantiene en un medio líquido del que extrae los nutrientes y al que elimina los desechos generados por su metabolismo. Los diferentes tipos de células que componen el órgano, se mantienen en su forma diferenciada y constituye una buena réplica del órgano original. Pero, su principal inconveniente es que no permite la propagación, ya que el crecimiento de células se produce únicamente en la periferia. Normalmente, este tipo de cultivo es difícil de mantener durante un tiempo prolongado debido a las diferencias potenciales de crecimiento de los distintos tipos celulares que constituyen el órgano. La falta de propagación tiene como consecuencia que para repetir el experimento se necesite nuevo material, por lo que se produce cierta heterogeneidad de muestras.

Cultivo de explantes.

Constituidos por fragmentos pequeños de tejidos que se adhieren a una superficie en la que generalmente crecen las células más periféricas del explante. Se podrán cultivar fragmentos de diferentes tejidos, como por ejemplo vellosidades coriónicas, tejidos epiteliales, conjuntivos, biopsias, etc.

Cultivo de células.

Este tipo de cultivo está formado por células dispersas que crecen en suspensión o adheridas a una superficie. Generalmente son cultivos que contienen un único tipo de célula y estas suelen ser homogéneas genéticamente. Es el tipo de cultivo más utilizado en la actualidad debido a su capacidad de propagación, es decir, de crecimiento mantenido. Según la procedencia de las células, los cultivos celulares pueden ser primarios o secundarios. 

Un cultivo se denomina cultivo primario cuando las células o tejidos procedentes de un ser vivo crecen sin haber pasado previamente por una fase de crecimiento in vitro. Un cultivo se denomina cultivo secundario cuando procede de una fase previa de crecimiento in vitro.

Cultivos de células primarios: Son cultivos preparados directamente a partir de un órgano o tejido. Las células de la sangre, líquido amniótico, médula ósea y tejidos se colocan directamente en los recipientes en contacto con el medio de cultivo idóneo. El cultivo de las muestras de sangre y médula ósea se realiza en suspensión, las células crecen libres en el medio, sin adherirse a un sustrato. Los recipientes utilizados en estos cultivos son tubos, como el que se observa en la imagen. Algunos de ellos tienen la base plana para facilitar el que todas las células estén en contacto con el medio al mismo tiempo.

El cultivo de las muestras de líquido amniótico y biopsias, se realiza en monocapa. En esta modalidad, las células se cultivan en unos recipientes especiales, placas o frascos de material plástico como los de la imagen, que han sido tratados específicamente para facilitar la adhesión de las células a su superficie. Las células se pegan a las paredes del recipiente y forman una capa o sábana que recubre la parte inferior del recipiente bañada por el medio de cultivo.

En el caso de las biopsias de tejidos la muestra puede cultivarse directamente, cortando el tejido en pequeños fragmentos (explantes) y colocando después cada uno de ellos en el recipiente de cultivo, o puede tratarse primero con enzimas proteolíticas del tipo colagenasa o tripsina que separan las células del tejido disolviendo la sustancia que las mantiene unidas antes de introducirlas en el recipiente de cultivo. A este tratamiento se le denomina digestión enzimática.

Los cultivos primarios tienen la ventaja de conservar la morfología y las características genéticas de las células del tejido original, pero tienen un período de vida corto.

El cultivo primario procedente de un órgano o tejido, consistirá probablemente en un mayor o menor número de células de diferentes tipos con diferentes capacidades de crecimiento. Para la mayor parte de los experimentos es necesario utilizar un único tipo celular. Por lo tanto se deberá de seleccionar el tipo celular necesario. Para ello podremos:

• Dejar las células crecer. Las células de crecimiento más rápido tomarán la dominancia del cultivo
• Controlar la composición del medio de crecimiento. La adición de factores de crecimiento o de inhibidores del crecimiento podrá seleccionar ciertos tipos celulares
• Separar las células mediante gradientes de densidad

Cultivos de células secundarios: Son aquellos que se obtienen a partir de un subcultivo  o pase de las células obtenidas en un cultivo primario o de otro secundario. También pueden proceder de una línea celular conservada en congelación. Cuando partimos de un cultivo primario, una vez seleccionado el tipo celular podemos mantener el cultivo durante un período de tiempo variable que depende del tipo y del origen de las células. Este tipo de cultivos puede propagarse un número limitado de veces, por ejemplo los fibroblastos se pueden subcultivar, alrededor de 30 veces.  Pasado este tiempo, las células entran en senescencia y pierden la capacidad de dividirse. Por lo tanto las células tienen una capacidad finita de divisiones mitóticas. A lo largo de las generaciones, las características de las células van cambiando. Al aumentar el número de pases, las células acumulan anomalías genéticas y van perdiendo su capacidad para dividirse.  Los cultivos secundarios se utilizan en una gran variedad de estudios: bioquímicos, en ensayos de toxicidad, en virología, en investigación etc.

¿Cuál es la dinámica de crecimiento de un cultivo?

La dinámica de crecimiento de un cultivo se conoce como la curva de crecimiento. La curva de crecimiento es una curva sigmoidea en la que se distinguen varias fases:

• Fase de latencia: Inmediatamente después de realizar un pase de células pueden entrar en una fase de latencia del crecimiento donde hay poco aumento en el número de células. Durante este tiempo, la densidad celular es baja, con células que cubren menos de 50% de la superficie (conocido como 50% de confluencia). La fase de latencia puede durar alrededor de 1-2 días.
• Fase de crecimiento (o exponencial): El número de células aumenta exponencialmente durante esta fase, y el crecimiento celular continuará siempre y cuando haya suficientes nutrientes para mantener el número de células en crecimiento. Las células son un50-80% confluentes, aproximadamente.
• Fase estacionaria: Durante esta fase, el número de células permanece constante, ya que algunas células mueren y otras se dividen lentamente. Eventualmente, todas las células morirán a menos que se agregue un medio de subcultivo fresco. En este punto, las células están a una densidad del  90-100% .

¿Cómo pueden crecer las células en los distintos soportes?

Como acabamos de mencionar,  el crecimiento de las células en cultivo puede ser de dos tipos, en monocapa y en suspensión.

Crecimiento en monocapa:

Las células formarán una monocapa que cubrirá la correspondiente superficie de crecimiento. Cuando ocupen toda la superficie, es decir, cuando alcancen la confluencia y su multiplicación sea inhibida cuando se establecen contactos entre sí, las células entran en un estado de quiescencia. Los recipientes para el cultivo de este tipo de células serán placas de Petri, frascos para el cultivo Roux, entre otros, que pueden ser de material de plástico o de vidrio previamente tratado. El anclaje al sustrato es un prerrequisito para la proliferación celular. Es el método utilizado para la mayoría de las células excepto para las hematopoyéticas. 

Las células se adhieren a la superficie y su desprendimiento para transferirlas a superficies mayores se realiza con agentes proteolíticos como la tripsina. Coincidiendo con el periodo de latencia, en un primer momento, las células se adhieren a la superficie del soporte, una vez que las células se han "pegado" a la pared del frasco de cultivo, comienzan a proliferar, extendiéndose por toda la superficie y formando colonias de células. Con el paso del tiempo, las células ocupan toda la superficie disponible. En este momento se produce el fenómeno conocido como inhibición por contacto. En este momento las células detienen su crecimiento aunque siguen vivas. Este momento  coincide con la  fase estacionaria de la curva de crecimiento. Es el periodo en el que las células se asemejan más a las células de origen. Llegada esta fase, para que reanuden su crecimiento, deberemos hacer un pase de células a un nuevo frasco de cultivo.

Crecimiento en suspensión.

En este caso, las células no necesitan adherirse a una superficie para crecer. Este tipo de crecimiento, es típico de células hematopoyéticas. Inicialmente, y coincidiendo con el periodo de latencia, las células se adaptan al nuevo medio y a las nuevas condiciones de cultivo antes de iniciar la proliferación.Pasado este periodo, las células crecen forma exponencial dispersas en el medio de cultivo. Llega un momento, en que el cultivo alcanza un volumen crítico en relación con el volumen de medio y los nutrientes que contiene. En este momento se produce el fenómeno de inhibición por densidad. Donde las células dejan de crecer pero siguen vivas. De nuevo para que continúen su crecimiento, necesitamos realizar un pase, que en este caso no necesitará de tripsina.

¿Cómo se comportan las células tras sucesivos pases?

Los sucesivos pases  de un cultivo celular primario, dan lugar a una línea celular primaria.

Una línea celular primaria, es aquella obtenida  a partir de un explante, o de tejidos u órganos mediante métodos mecánicos y/o enzimáticos.  Aunque inicialmente el cultivo primario consistirá en un conjunto de células de diferentes tipos con diferentes capacidades de crecimiento, según se van realizando pases, la población celular con mayor tasa de crecimiento irá desplazando al resto, por lo que la población celular se hará uniforme y homogénea. Esto sucede alrededor del tercer pase.

Una línea celular primaria, tiene una vida finita. Las células crecen durante un cierto número de pases que depende, sobre todo, del tipo celular y de las condiciones de cultivo. Así, los hepatocitos de adultos sólo se mantienen como cultivo primario, las células endoteliales de cordón umbilical humano permanecen en cultivo de 3 a 9 pases y los fibroblastos dérmicos humanos pueden superar los 20 pases. Sin embargo, al final, todas ellas entran en una fase de senescencia en la que se acumulan numerosas anormalidades y se pierden las funciones especializadas, lo que conduce a la muerte del cultivo.

Sólo ocasionalmente líneas celulares procedentes de un cultivo primario pueden mantenerse durante más generaciones de las esperadas. Ello es debido a la aparición en el cultivo de células inmortales. Estas células forman líneas estables o continuas. En la mayoría de los casos se desconoce la razón de la aparición de células inmortales pero se ve favorecida por infecciones virales o tratamientos con mutágenos (físicos o químicos), lo que podría estar relacionado con la pérdida, espontánea o inducida, de las vías de control de la división celular.

La capacidad de un cultivo celular primario para establecerse como línea estable está relacionada directamente con su variabilidad genética. En general, una línea celular estable será tanto más fácil de establecer o cultivar cuanto más indiferenciada esté, con las excepciones de las líneas tumorales de células diferenciadas. Los cultivos primarios de muchos tipos celulares son posibles porque las células pierden algunas de sus propiedades diferenciadas, entre ellas la capacidad de dividirse. Esta pérdida de algunas de sus propiedades características puede deberse a desdiferenciación o a desadaptación. La desdiferenciación implica una pérdida irreversible de una propiedad diferencial del tipo celular. En la desadaptación, la pérdida no es irreversible ya que se debe a la ausencia de algún tipo e señal (hormonal, nerviosa, etc.) y que basta con recuperar esa señal para que la característica se vuelva a expresar.

 Las líneas celulares continuas, son células resultantes de un proceso de transformación de las células normales, relacionado con una pérdida de los mecanismos de control celular. Son células que crecen indefinidamente en cultivo (inmortales), pierden la dependencia de anclaje, característica de las células que crecían en monocapa, pierden la inhibición por contacto, pueden invadir tejidos provocando tumores, y acumulan anomalías genéticas. Siendo habitualmente aneuploides.

Existen cultivos abiertos y cerrados.

Hay cultivos celulares que se realizan cerrando herméticamente los tapones de rosca de los tubos y frascos de cultivos. Son cultivos cerrados donde no hay intercambio de gases (oxígeno y CO₂) entre el interior del recipiente y el exterior. Sin embargo hay veces que las células se cultivan en sistemas abiertos. En estos sistemas el aire del incubador puede pasar al interior del cultivo, gracias a que los tapones de los frascos y tubos se dejan semi-abiertos, en una posición "ventilada" que permite el intercambio de gases. Estos cultivos se realizan en atmósferas de CO₂ a una concentración del 5 %.