Un punto importante en las técnicas de cultivo celular es la selección del medio de cultivo adecuado para el crecimiento celular. Un medio de cultivo es un medio artificial preparado mediante la mezcla de componentes purificados que ayudan al crecimiento y mantenimiento de una variedad de estirpes celulares de mamíferos y de otros tipos in vitro, ya sea como cultivos dependientes de anclaje o cultivos en suspensión. Los cultivos celulares proporcionan comodidad, control y reproducibilidad de los resultados. Los medios de cultivo celular se suministran habitualmente como líquidos, concentrados, en polvo u otras formas sólidas preesterilizados listos para usar en frascos, o como bolsas selladas de un solo uso para su integración en sistemas de cultivo celular compatibles.
En la imagen se observa una botella de medio utilizado para cultivar células. Si miras con atención su etiqueta verás una serie de nombres que corresponden a las sustancias más importantes que ese medio lleva en su composición. Al lado tienes otra botella más pequeña con una sustancia que si te fijas bien está congelada.
¿Cuáles son estos componentes y qué función realizan en el cultivo celular?
Todos los medios que se utilizan para cultivar células son medios definidos ( es decir, se conoce exactamente su composición) que aportan los nutrientes necesarios para que las células puedan realizar su metabolismo, esto es obtener la energía necesaria para crecer y multiplicarse. Los medios de cultivo constan generalmente de dos partes: Un medio basal nutriente y los suplementos.
Sales minerales
La base de un medio de cultivo es una solución salina equilibrada que es una mezcla de sales inorgánicas, den la que se disuelven el resto de componentes. Son componentes habituales, el cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, cloruro de magnesio, fosfato sódico, fosfato potásico y bicarbonato sódico. Este conjunto de sales permite controlar el pH y la presión osmótica del medio . Esta solución de sales recibe el nombre de solución salina equilibrada y permite el cultivo de las células durante un tiempo corto (2 o 3 días). Aunque normalmente es la base de los medios de cultivo, también puede usarse de forma individual para diluir medios más completos, como medio de disección o lavado, o para incubaciones cortas que requieren un medio isotónico no completo nutricionalmente. Hay dos tipos de soluciones salinas equilibradas que se utilizan frecuentemente en cultivo celular y cuyos nombres verás en catálogos y manuales:
- HBSS (Solución salina equilibrada de Hanks).
- EBSS (Solución salina equilibrada de Earle).
Glucosa
Suministra a las células una fuente de carbono y energía. La glucosa, supone la fuente de energía en muchos medios. In vitro, es metabolizada preferentemente vía glucólisis hacia piruvato que puede ser convertido en lactato o acetoacetato que entra el ciclo de Krebs, y genera CO2.
Aminoácidos
Es necesario suplementar el medio basal con los aminoácidos esenciales. Un suplemento común es el de glutamina, a 2 mM final, aunque hay algunas líneas celulares pueden usar el glutamato. La glutamina es inestable en el medio, y se recomienda añadirla a partir de un stock concentrado (100x) que se mantiene congelado, no más de una semana antes de añadirla al medio al cultivo (conservando a 4 C).
Vitaminas
En medios bien definidos se suplementan todas las vitaminas. La limitación de vitaminas afecta a la supervivencia de las células y provoca una reducción de la tasa de crecimiento sin alterar en exceso la densidad celular.
Suplementos orgánicos de bajo peso molecular
Como pueden ser lípidos, ácidos grasos, piruvatos, nucleosidos, intermediarios del ciclo de Krebs, etc
Antibióticos y antifúngicos
A fin de evitar el crecimiento de contaminantes en el cultivo se suele suplementar éste con sustancias antibióticas de diferente espectro de acción. La adición de antibióticos ha de ser estrictamente controlada para evitar efectos nocivos sobre el cultivo. Es importante tener especial cuidado cuando se combinan dos o más antibióticos.
Mezclas de antibióticos de uso más común:
Penicilina (100 U/ml) / Estreptomicina (100 μgr/ml). Combinación anti-microbiana.
Penicilina (100 U/ml) / Estreptomicina (100 μgr/ml) / Fungizona. Combinación antimicrobiana y antifúngica.
Gentamicina (50 μgr/ml). Antimicrobiana, conviene ir alternándola con la penicilina-estreptomicina.
Anfotericina-B (2.5 μgr/ml). Antifúngico. Se han observado algunos efectos secundarios sobre el crecimiento de células de médula ósea humana en cultivo.
Suero
Aporta hormonas y factores de crecimiento, factores de adhesión e inhibidores de proteasas. Los tipos de suero empleados más habitualmente son:
suero de ternera (CF), suero bovino fetal (FCS), suero de caballo (HS), y suero humano (HuS). El más usado es el suero de ternera, mientras que el suero bovino fetal es usado en líneas más exigentes, y el suero humano en líneas humanas.
La utilización del suero puede suponer varios problemas:
En el suero existen gran cantidad de componentes presentes en cantidades variables que pueden influir notablemente en el cultivo (hormonas, factores de crecimiento…). Algunos factores séricos como el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) estimula la proliferación de fibroblastos, lo que puede ser un problema en el establecimiento de cultivos primarios especializados.
Además, el suero no tiene una composición definida y esta varía de lote a lote. Cada lote se puede emplear como máximo 1 año, probablemente deteriorándose a lo largo de ese tiempo, a pesar del almacenamiento a baja temperatura (-20ºC). Cada cambio de lote de suero requiere realizar una serie de controles tediosos y costosos para valorar el comportamiento de las células ante el nuevo suero. Si se cultivan varios tipos celulares cada uno puede requerir un lote diferente, lo que complica el almacenamiento e incrementa los costes. Crea una dependencia importante de un suministro que no siempre puede mantenerse con la periodicidad y calidad requerida. Si se han de purificar productos del medio de cultivo la presencia de los componentes del suero dificulta notablemente estos procesos.
Por último, el suero supone uno de las fuentes más común de contaminación por microorganismos, sobre todo por virus y micoplasma, lo que representa un grave peligro para el cultivo. En conjunto supone un gran inconveniente para la estandarización de protocolos experimentales y de producción.
Todo esto, supone un gran inconveniente en la estandarización de protocolos experimentales. Por eso en los últimos años a fin de reemplazar el suero se han desarrollado una serie de sustitutos comerciales como son SerXtend, Ventrex, Nu-serum.
Aunque como hemos dicho un medio de cultivo generalmente es un medio de composición definida. La adición de suero convierte al medio, en medio no definido, debido precisamente a la variabilidad tanto cualitativa como cuantitativa de los componentes del suero. Para evitar esta variabilidad, es posible utilizar componentes individuales que se añaden al medio con composición definida (factores de adhesión, hormonas, factores de crecimiento, etc).
Por tanto podríamos definir medio no definido como aquel medio que tiene componentes cuya composición química y concentración no están determinados. Cuando a un medio definido se le adiciona el suero, este medio pasa a ser medio no definido.
Respecto al porcentaje de suero, lo normal es empezar con porcentajes altos de entre el 10-20%, y probar a introducir suplementos que permitan reducir esta cantidad.
Un aspecto importante a tener en cuenta respecto al suero, es la necesidad de llevar a cabo la descomplementación del suero para inactivar las proteínas del complemento que, en algunos casos, pueden producir alteraciones en los cultivos celulares. Para ello, basta con mantener el suero en el baño a 56ºC, durante 30 minutos.
Soluciones amortiguadoras o soluciones tampón:
Las células son muy sensibles a los cambios de pH, por ello los medios de cultivo deben estar tamponados. Las solucions tampón máshabituales son:
- Tampón bicarbonato: se utiliza en cultivos abiertos en atmósferas de CO2, a una concentración de 10 mM.
- HEPES: un tampón no iónico que se utiliza en los sistemas de cultivo cerrados.
La solución tamponadora más empleada es el tampón bicarbonato, que equilibra el CO2 atmosférico, a pesar de su escasa capacidad tamponadora, debido a su bajo coste, baja toxicidad, y beneficios nutricionales para el cultivo.
El HEPES es la solución tamponadora de elección para células de crecimiento rápido por su elevada capacidad tamponadora en el rango de 7,2 a 7,6 y se emplea en concentraciones de entre 10 y 20 mM.
Indicadores de pH:
Los medios de cultivo son generalmente medios tamponados (con HEPES o bicarbonato) para mantener un pH alrededor de 7.4. Los indicadores de pH, como el rojo fenol, cambian de color a medida que aparecen catabolitos ácidos en el medio como resultado del metabolismo celular. En condiciones normales, a pH 7.4 el color del medio será rojo. El rojo fenol presenta los siguientes colores según el pH del medio:
- rojo a pH 7,4
- naranja a pH 7,0
- amarillo a pH 6,5
- púrpura a pH 7,8
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de sus componentes, pero lo más habitual es adquirir los medios comerciales. Son medios de cultivo comunes:
Medio Basal de Eagle (BME). Aminoácidos esenciales.
Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM). Contiene más aminoácidos y en mayor concentración que el BME. Se ha convertido en el medio estándar del cultivo celular. Contiene HBSS o EBSS y se puede suplementar con varios aminoácidos no esenciales y vitaminas dependiendo del tipo de células a cultivar.
R.P.M.I. 1640. Medio diseñado para el crecimiento de linfoblastos y líneas celulares leucémicas. Es el medio utilizado para cultivar muestras de sangre que contienen linfocitos estimulados con fitohemaglutinina.
Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). Contiene cuatro veces la concentración de aminoácidos y vitaminas que el B.M.E.
Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy completo que incluye en su formulación albúmina bovina, transferrina, etc
McCoy 5A. Medio diseñado para el crecimiento de líneas celulares diploides.
Medio L-15 de Leibovitz. Utilizado para el cultivo de virus.
Medio F-10 de Ham. Para el crecimiento de líneas celulares humanas. Debe ser suplementado con proteínas y hormonas. Contiene Fe, Cu, Zn.
Medio F-12 de Ham. Útil para el crecimiento de líneas celulares con suplementos proteínicos. Tanto este como el anterior, se utilizan para cultivar células de líquido amniótico.
Medio 199. Muy usado para el cultivo de células no diferenciadas y estudio de cromosomopatías
Son uno de los componentes fundamentales de la respuesta inmunitaria. El complemento consta de un conjunto de proteínas plasmáticas implicadas en distintas cascadas bioquímicas, cuyas funciones son potenciar la respuesta inflamatoria, facilitar la fagocitosis y dirigir la lisis de células.