Para cultivar células no basta solo con añadir al medio nutrientes, debemos asegurarnos que las condiciones del medio no varían a lo largo del período de cultivo. Esto se hace añadiendo a los medios determinados componentes que aseguren unas condiciones óptimas de  Tª (habitualmente, 37ºC), pH y osmolalidad, y una concentración de gases  adecuada (5% C0₂  y 95% O₂).   Por otra parte, un cultivo supone sacar a las células de su entorno fisiológico para hacerlas crecer en un recipiente que las aísla del exterior. Las condiciones de cultivo varían ampliamente para cada tipo celular, y la variación de las condiciones para un tipo celular concreto, puede dar lugar a la expresión de diferentes fenotipos.

El soporte físico en el que se cultivan las células.

• Plástico desechable: Existen en el mercado un gran número de recipientes que permite crecer las células a pequeña, mediana y gran escala.  Los contenedores más comunes, son los frascos de cultivo, también llamados Flask, diseñados y tratados para facilitar la adherencia y el crecimiento de las células. Fabricados en poliestireno, son estériles y con áreas de crecimiento desde 25 hasta 175 cm², que cuentan con un tapón diseñado para favorecer el intercambio gaseoso. En general, son no reutilizable, lo que supone una menor manipulación y un  menor riesgo de contaminación. También son muy utilizadas las placas multipocillo, con un número de pocillos variable que oscila entre 6 y 96.  Los pocillos están cubiertos por una tapa no hermética que les hace buenos recipientes para experimentos puntuales pero malos para evitar contaminaciones. Un tipo especial de placa multipocillo son las placas Transwell, dotadas de cámaras individuales que se acoplan a los pocillos, muy utilizadas para estudios de migración e invasión. Cuando se plantea un cambio de tamaño del soporte físico, se deben  tener en cuenta múltiples factores entre los que se encuentran el aporte suficiente de nutrientes y el garantizar el intercambio suficiente de gases entre otros.

Otros materiales menos usados son:

• Vidrio: Reutilizable, fácil de limpiar y esterilizar por calor (autoclave) y con buena capacidad óptica para observaciones con microscopía.
• Matrices tridimensionales: Forman redes tridimensionales porosas que ayudan a que determinados tipos celulares crezcan de forma parecida a como lo hacen in vivo.
• Microesferas de Sephadex: Son microesferas en suspensión, en donde crecen adheridas las células. De esta manera las células dependientes de anclaje crecen adheridas a una superficie (microesfera) pero aumentando notablemente la superficie de crecimiento disponible.
• Sustratos metálicos: Apropiados para determinados tipos de células, como las células de glía.

Son parámetros fisicoquímicos del medio que deben ser controlados:

Temperatura:

la temperatura tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las células, por lo que un buen control de la misma es importante durante la incubación. La temperatura de 37 ºC es ideal para cultivas células humanas. Las células toleran relativamente bien las bajadas de Tª, pero son sensibles a las temperaturas elevadas. En general, toleran bien variaciones de  entre 35 y 38 ºC,  pero hay que tener cuidado porque un aumento de temperatura mayor producirá la muerte de las mismas.

Influye en el pH del medio, por lo que se recomienda ajustar el pH del medio 0,2 unidades por debajo del óptimo, a temperatura ambiente, o bien preparar el medio completo, incluso suero, dejar equilibrar O/N en la estufa y después ajustar el pH, antes de añadirlo al cultivo.

Humedad:

Debe ser suficiente para evitar la evaporación del medio de cultivo. Es controlada por el incubador que posee dispositivos para mantener la humedad en niveles óptimos de alrededor del 95%.

pH:

El crecimiento de las células animales en un medio de cultivo es óptimo cuando el pH del medio se encuentra en el intervalo entre 7,2 y 7,4, similar al pH fisiológico. Para mantener este pH sin apenas variaciones se incorporan a los medios de cultivo tampones.

Distintas situaciones pueden ocasionar cambios en el pH del medio de cultivo, aunque solo algunas reflejan sufrimiento en las células. Por ejemplo, el metabolismo celular, conlleva la liberación de ácidos al medio de cultivo. Esta liberación puede ser más elevada dependiendo de los nutrientes incorporados al medio de cultivo y de la densidad de la población celular. Normalmente las soluciones tamponadoras que incluyen los medios de cultivo y los cambios periódicos de dichos medios, evitan cambios en el pH debido a este factor.  Una disminución de la Tª del incubador, favorece la disolución de CO₂ en el medio y lo acidifica. Por otro lado, algunos microorganismos contaminantes de los cultivos animales pueden acidificar o alcalinizar el medio de cultivo. En este caso, el indicador de pH facilita rápidamente la identificación de la contaminación. Un cambio en el color del medio producido por un viraje del indicador de pH de dicho medio hacia pH más ácidos indicará normalmente un exceso de productos de desecho en el medio y aconsejará el cambio de medio por medio fresco.

Osmolaridad:

La osmolaridad, es la concentración de partículas (moléculas o iones) en disolución. Se define el osmol, como un mol de partículas. Por lo tanto:

osmolaridad: número de moles de partículas / Litro de disolución (osmoles/L)

osmolalidad: número de moles de partículas / Kilo de disolución (osmoles/Kg)

Ambos términos son similares a molaridad y molalidad, pero mientras que estos hacen referencia a concentraciones de un único soluto (elemento o compuesto) en una disolución, osmolaridad y osmolalidad se refieren al conjunto de todos los solutos presentes en la disolución.

Mantener la osmolaridad en el cultivo es importante porque ayuda a regular en flujo de sustancias que entran y salen de las células. El rango de presión osmótica óptima para el cultivo varía entre 260 y 320 mOsmol/L. Un medio de cultivo hiperosmótico, provoca la salida de agua del interior de la célula y un medio de cultivo  hipoosmótico,  la entrada de agua al interior de la célula a través de la membrana plasmática. Cualquiera de las dos situaciones provocan la muerte de la célula. Se regula controlando la concentración de sal del medio de cultivo. La osmolaridad del medio se mantiene estable evitando la evaporación del medio de cultivo colocando los frascos de cultivo en un incubador saturado de humedad.

Muchas células en cultivo tienen una amplia tolerancia frente a la osmolalidad del medio, creciendo bien con pequeñas variaciones dependiendo de la especie considerada.

Es recomendable emplear medios ligeramente hipotónicos para compensar la evaporación durante el periodo de incubación, especialmente en incubadores sin control de la humedad ambiente.

Hay que tener en cuenta que la adición de HEPES, de drogas disueltas en ácidos fuertes y la neutralización posterior pueden afectar fuertemente a la osmolalidad del medio.

Tensión superficial:

Se ha de mantener baja, y en general sólo se ve alterada por la aparición de espumas en los cultivos en suspensión donde se burbujea CO₂.

La espuma produce un aumento de la desnaturalización de proteínas e incrementa el riesgo de contaminación si la espuma alcanza el cuello del recipiente de cultivo. En estos casos es recomendable emplear un agente antiespumante de silicona.

Viscosidad:

La viscosidad del medio viene determinada fundamentalmente por el contenido en suero y tiene poca influencia sobre el crecimiento. Es inversamente proporcional al daño celular, por lo que sí es importante para evitar el daño celular en la agitación del cultivo (menor daño a más viscosidad) y en la tripsinización.

Se puede incrementar la viscosidad, especialmente en medios libres de suero, añadiendo al medio carboxi-metil-celulosa o polivinilpirrolidona.

Atmósfera gaseosa:

CO₂:  El CO₂ tiene un papel importante en los cultivos celulares. Cuando no es posible controlar el CO₂, los medios de cultivo que utilizan bicarbonato como tamponador de pH se alcalinizan (pH > 8). En esas situaciones se pueden emplear medios con tampones orgánicos como HEPES  o Tris, estos tampones ajustan rápidamente el pH del medio a pH 7,4, pero hay que tener en cuenta que pueden ser tóxicos para bastantes tipos celulares o generar problemas de adaptación. Por lo que se emplearán en pequeñas cantidades cuando sea difícil mantener el pH con el tampón CO₂ -bicarbonato.

La fracción de CO₂ disuelta en el medio debe estar en equilibrio con el ión bicarbonato:

CO₂ + H₂O ⇔ H₂CO₃ ⇔HCO₃- +H⁺

CO₂ + H₂O ⇔HCO₃- + H⁺

Como resultado, el nivel de CO₂ se mantiene estable dentro del frasco de cultivo, lo que permite que el pH permanezca en un nivel compatible con el crecimiento de las células.

Los cultivos abiertos necesitan para tener éxito concentraciones de CO₂ entre el 5 y el 10 % y también ciertos niveles de humedad. La atmósfera de CO₂ se consigue conectando la estufa a una fuente regulable de este gas y la humedad colocando en la parte baja de la estufa una bandeja con agua estéril a la que se le añade un compuesto que reduzca el riesgo de contaminación bacteriana o fúngica (benzoato de sodio).

Oxígeno: Es aportado por la atmósfera y queda disuelto en el medio. En general, las concentraciones de oxígeno atmosférico son suficientes para cubrir las necesidades de cualquier cultivo de células.

Luz Visible:

Tanto las células como los medios de cultivo deben ser expuestos lo menos posible a  la luz, ya que puede favorecer la aparición de componentes  tóxicos que afecten a la célula negativamente.