2.5.- Puesta en marcha del cultivo.

Caso práctico

En la imagen se observa el interior de una cabina de flujo laminar en la que se han preparado varios tubos de cultivo celular para sembrar en ellos las muestras.
Cabina de flujo laminar con tubos de cultivo celular.

Marta enseña a Carlos y Susana cómo se añaden los suplementos a un medio de cultivo. Muchos de los medios utilizados en las técnicas de rutina vienen ya listos para ser usados, sin necesidad de manipulación previa, pero Marta considera importante que los alumnos y alumnas que pasen por esta Sección conozcan la manera de incorporar los suplementos al medio base por separado. Es una buena oportunidad para trabajar en la cabina de flujo laminar.

Una vez mezclados todos los componentes, entre los tres y, trabajando por turnos en la cabina de seguridad, distribuyen los mililitros del medio de cultivo preparado en los tubos y frascos que se van a utilizar antes de añadirles la muestra. En el día de hoy además de la muestra de sangre periférica de Susana hay varios líquidos amnióticos para diagnóstico prenatal y ha llegado también una biopsia de un tumor de colon. Carlos da un repaso a los protocolos antes de comenzar con el procedimiento de cultivo.

Muchos de los medios utilizados para cultivo celular deben ser suplementados antes de su utilización. Los suplementos necesarios para realizar el cultivo en condiciones óptimas se añaden bajo estrictas condiciones de asepsia. Se trabajará siempre en cabina de flujo laminar, los materiales con los que trabajemos deberán ser estériles, y aquellos componentes que no pueden ser esterilizados, por ser termosensibles y estropearse con el calor, se añaden al medio de cultivo por filtración con filtro de 0,22 micras.

Se trata de la ausencia de materia séptica, es decir, la inexistencia de sustancias que causan putrefacción y de gérmenes patógenos. Por tanto, es un estado sin infección. También se conoce como asepsia al conjunto de procedimientos y técnicas utilizados para evitar que lleguen a nuestro organismo gérmenes, bacterias, virus y hongos.

La esterilización por filtración se logra por el paso de un líquido o un gas a través de un material capaz de retener los microorganismos presentes. Para la filtración esterilizante se pueden usar combinaciones de un filtro de profundidad con un filtro de superficie que tenga un tamaño de poro de 0.22 μm. La mayor parte de los filtros de membrana se pueden esterilizar en autoclave y luego se manipulan asépticamente al ensamblar el equipo.

Una vez preparado y suplementado el medio se preparan alícuotas del mismo en los recipientes de cultivo y se añade en ellos la muestra. Los protocolos de puesta en marcha del cultivo varían en función de la muestra a cultivar, a continuación se indican algunos pasos generales incluidos en la mayoría de los protocolos.

Esquema en el que se muestran los pasos más importantes de la puesta en marcha de un cultivo de sangre periférica.
Esquema en el que se muestran los pasos más importantes de la puesta en marcha de un cultivo de las muestras de médula ósea.
Esquema en el que se muestra de forma resumida los pasos más importantes de la puesta en marcha de un cultivo de líquido amniótico.
Esquema en el que se muestran los pasos más importantes de la puesta en marcha de un cultivo a partir de una biopsia de tejido sólido.

En relación a la puesta en marcha de los diferentes cultivos, debes tener en cuenta que:

  • Al cultivar sangre periférica debes añadir un mitógeno al medio (si éste no está incorporado ya en el). El mitógeno utilizado es la fitohemaglutinina, una sustancia que estimula la proliferación de los linfocitos T.
  • En algunos tipos de cultivo de médula ósea es necesario también utilizar mitógenos. A veces es necesario añadir mitógenos para facilitar la división de los linfocitos B. En otros casos se puede realizar un estudio directo de la muestra en el momento de su recepción.
  • En el cultivo de líquido amniótico: No se debe mover el tubo de cultivo durante la fase inicial de asentamiento (de 5 a 7 días) para que las células puedan adherirse bien al sustrato A partir de ahí los cultivos se examinan periódicamente para comprobar el estado de proliferación, subcultivándolos cuando sea preciso.
  • Tejidos sólidos: Se realiza a partir de los explantes de la biopsia y se desarrollan sobre todo fibroblastos, Tras el período inicial los cultivos se examinan cada dos o tres días, para comprobar el estado de proliferación celular.