Medio de cultivo y reactivo utilizado en la tripsinización.

Disgregación celular.

Cuando se quieren realizar cultivos celulares a partir de órganos o tejidos, el primer paso consistirá en separar las células de interés de la matriz extracelular en la que se encuentran y entre si.

Existen varios procedimientos para realizar la separación de las células de los sustratos:

• Mecánicos: se basan en cortar, incluso triturar, fragmentos de órganos o tejidos colocados sobre una placa Petri con medio de cultivo o solución tampón. Las células pueden ser disgregadas con la ayuda de un bisturí, tijeras o pinzas. A continuación las células pueden ser filtradas a través de una malla con un diámetro de poro lo suficientemente grande como para permitir solo el paso de estas. Las células que se han separado del  tejido, serán recogidas en un tubo aparte.
• Enzimáticos: se trata el tejido o el órgano con enzimas  (colagenasa, tripsina, pronasa) para eliminar las uniones célula-célula, célula-matriz.  El tiempo y la temperatura de actuación de estos enzimas sobre las células debe estar ajustada para asegurar su viabilidad. Transcurrido el tiempo de digestión enzimática, se eliminan los restos de tejidos mediante el uso de un embudo provisto de varias capas de gasa muy fina y estéril.

En la práctica se suelen emplear técnicas que combinan varios métodos. La elección del método depende de la naturaleza de las células y los tejidos.

Propagación de los cultivos.

Otra labor básica en el laboratorio de cultivo celular es la propagación de los cultivos.

Cuando queremos seguir manteniendo el cultivo y el espacio en el recipiente se agota es necesario realizar un subcultivo. Dividir el cultivo original en dos o más partes y sembrar cada una de ellas (alícuota) en un frasco diferente, para que de esta manera las células vuelvan a tener espacio y la división pueda seguir realizándose. En células adherentes que crecen en monocapa se debe proceder a "levantar"  (despegar) las mismas de la superficie en la que crecen. Para ello será necesario romper la malla de proteínas que mantiene a las células unidas al soporte físico del cultivo, mediante  tripsinización o raspado. En células en suspensión será suficiente con realizar una dilución en medio nuevo (o bien adición de medio tras centrifugación).

Existen diferentes métodos para separar las células del soporte, y el uso de un método o de otro dependerá en buena parte del tipo de célula:

• Mecánicos: En cultivos celulares se emplean con frecuencia los métodos de rascado (“scrapping”) de la placa para arrancar las células adheridas. Se recorre el cultivo con unas pequeñas espátulas que levantan las células a su paso. También se puede golpear la placa o el frasco ligeramente para que las células se suelten del sustrato. 
• Químicos. Se trata de la adición de agentes quelantes de iones divalentes, por ejemplo EDTA. Este compuesto atrapa iones como el Ca⁺⁺ o el Mg⁺⁺ que estabilizan la unión de las células a los soportes. De esta manera, al reducir la concentración de los iones que estabilizan las uniones célula-matriz, las células se despegan más fácilmente.
• Enzimáticos. Tratamiento del cultivo celular con soluciones de proteasas activas como la colagenasa, la elastasa o la tripsina.

Todas estas operaciones deben realizarse manteniendo la viabilidad del cultivo. No debemos dejar que las células mueran durante la operación.

Tras el levantamiento de las células la suspensión se reparte en nuevos frascos y se añade medio nuevo, que neutraliza el efecto de la tripsina y permite continuar el cultivo.

Es importante controlar la densidad (la cantidad) de células que se colocan en cada frasco. Se estima que para que el cultivo tenga éxito la densidad inicial de las células debe ser de 10 a 50 • 10³ células/ml. si la densidad es menor el cultivo fracasará y si es muy alta las células morirán.

La tripsinización es el método más empleado para separar del sustrato  las células que crecen en monocapa.  Es un método enzimático que se basa en la incubación de las células con tripsina a 37 ºC durante un corto periodo de tiempo. La fórmula comercial de la tripsina (0,25%) suele ir acompañada de EDTA (1 mM), que favorecerá la acción de la tripsina y a la vez disminuirá su tiempo de actuación. Es importante lavar bien con solución salina (PBS) la monocapa de células para eliminar por completo el suero, puesto que este suele contener inhibidores de la acción de la tripsina.