2.9.- Congelación y descongelación de células

Congelación de células.

Es importante disponer de alícuotas congeladas de las células con el fin de minimizar la acumulación de cambios genéticos en las líneas continuas, evitar la senescencia y la transformación en las líneas finitas, y evitar la pérdida accidental de una línea por muerte o contaminación.

En la actualidad el mejor método de almacenamiento es la congelación en nitrógeno líquido. Las células crecidas hasta un 70-80% de confluencia (fase logarítmica del cultivo) se resuspenden. La suspensión celular, idealmente de alta concentración celular, debe ser congelada lentamente (descenso de aproximadamente 1ºC/min) en presencia de un agente preservante como el glicerol o el dimetilsulfóxido (DMSO). Esto se consigue introduciendo los tubos con las células en un recipiente especial con propanol, e introduciéndolo primero en el congelador de -80ºC. Posteriormente las células son transferidas rápidamente a nitrógeno líquido (-196ºC) cuando alcanzan una temperatura inferior a -50ºC. Hasta llegar cerca de -80ºC, la temperatura debe bajar lentamente para evitar la formación de cristales intracelulares que puedan dañar a las células.

La membrana celular es la estructura que sufre mayor daño en la congelación, esto es debido a la pérdida de fluidez de los componentes lipídicos, dando un alto grado de fragilidad celular. La lesión celular crioinducida se explica en función de la formación de hielo intracelular y del estrés osmótico al que se ven inducidas durante la congelación.

Existen muchas soluciones de congelación de células. Se recomienda el uso de 10% DMSO en suero bovino fetal (FBS), aunque algunas líneas continuas se congelan con la misma eficacia en 10% DMSO en medio completo (usualmente DMEM 10% FCS).

En nitrógeno líquido se almacenan durante largos periodos de tiempo (años) sin deterioro celular apreciable. El almacenamiento a temperaturas tan bajas como -80ºC también es posible aunque se detecta deterioro de las células a las pocas semanas y/o meses.

El objetivo de la criopreservación es mantener la viabilidad y funcionalidad celular. Este se consigue porque el frío enlentece las reacciones enzimáticas que se producen dentro de las células.

Protocolo de congelación:

Tripsinización de los Flask para levantar todas las células.

• Quitamos el medio de cultivo del Flask y lavamos tres veces con PBS, este debe estar atemperado a 37ºC.
• Añadimos tripsina al 1 X,  y la dejamos actuar durante 5 minutos a 37ºC, esto dependerá del tipo de células con las que trabajemos.
• Pasado este tiempo añadimos  medio de cultivo con suero para inactivar la tripsina (tres veces más de medio que de tripsina). Ya que la tripsina es una enzima peptidasa, que rompe los enlaces de las proteínas mediante hidrólisis para formar péptidos o proteínas de menor tamaño.
• Pipeteamos bien la mezcla, procurando levantar algunas células si no se han despegado del todo.
• Tomamos la mezcla con una pipeta y la introducimos en un tubo Falcon para centrifugarla, la centrifugación se hará a 450 g durante 5 minutos. Con esto conseguimos eliminar la tripsina y poder añadir a las células medio nuevo.

 Recuento de las células con azul tripán.

• Para ello resuspendemos las células que antes hemos centrifugado en medio de cultivo, la resuspendemos bien, y tomamos 20 μl, a los cuales los vamos a añadir otros 20 μl de azul tripán, los resuspendemos bien y procedemos a introducirlo en la cámara de Neubauer.

Cálculo de la cantidad de células que tenemos.

• Dividimos el nº de células contadas entre el nº de cuadrantes en los que las hemos contado, esto es para hacer un cálculo medio de las células que hay por cuadrante.
• El nº que nos ha salido lo multiplicamos por 2, que es el factor de dilución que hemos hecho al añadir el azul tripán. El resultado obtenido lo multiplicamos por 10000. El número que nos dé, será la cantidad de células que tenemos por ml, y calculamos, también la cantidad total de células que tenemos.

 Preparación del medio de congelación.

• está compuesto por 90% de Suero Fetal Bovino y 10% de DMSO.

 Añadimos a cada criotubo 2 .10⁶ células por mililitro de medio de congelación.

Introducimos los criotubos en un recipiente especial, que contienen propanol, y lo llevamos al congelador de -80ºC.

• Pasadas 4 horas, o al día siguiente, podemos introducir los criotubos en el tanque de nitrógeno líquido.
• La función del propanol, es conseguir que la temperatura descienda de forma constante, a 1ºC/minuto, hasta alcanzar los -80ºC.

Descongelación de células.

Los periodos críticos para la supervivencia celular durante la criopreservación son la fase inicial del congelación y el periodo de retorno a las condiciones fisiológicas normales, por ello la descongelación de los stocks se ha de realizar rápidamente, diluyendo la suspensión y eliminando el agente preservante con la máxima rapidez. Podemos clasificar los distintos métodos, de acuerdo a la velocidad de congelación y descongelación en protocolos de congelación lenta-descongelación lenta, congelación lenta-descongelación rápida (esta es la mas usada).

La descongelación de las células debe de ser muy rápida, puesto que esto previene la formación de cristales en el momento en que la temperatura baja de -50ºC a 0ºC, si el proceso se lleva a cabo lentamente causa daño celular y pérdida de viabilidad.

• Según saquemos las células del nitrógeno líquido, lo que debemos hacer es introducirlas en el baño a 37ºC, para que se descongelen lo antes posible.
• Una vez descongeladas las resuspendemos en un tubo de centrífuga con medio de cultivo suficiente para conseguir que el DMSO quede reducido a una concentración de un 1%, esto se realiza para lavarlas bien, y eliminar en el primer lavado la mayor cantidad posible de DMSO, ya que este daña las células.
• Las centrifugamos durante 10 minutos a 450g.
• Se quita el sobrenadante y se resuspende el pellet, luego se siembran todas en un soporte de tamaño adecuado.
• Cambiarlas el medio al día siguiente para quitar los posibles restos de DMSO que puedan quedar.