Tras el "arresto" de los cromosomas en metafase, Carlos y Susana se disponen a realizar los pasos del procedimiento de sacrificio celular.

Realizarán sobre la muestra de sangre de Susana lo mismo que vean hacer a Marta con el resto de las muestras que tienen para el sacrificio. El procedimiento es largo y consta de dos partes: Choque hipotónico y fijación.

El primer paso es la preparación e identificación tanto del material (tubos y pipetas Pasteur) que se va a utilizar, como de los reactivos necesarios para llevarlo a cabo:

• La solución de choque hipotónico: KCl a una concentración 0,075 M.
• Los fijadores: Soluciones de metanol y acético a concentraciones diferentes.

El protocolo de sacrificio celular incluye entre sus pasos tres operaciones fundamentales:

• Centrifugaciones para recoger las células. Realizadas a 3000 rpm durante 10 minutos. En estas condiciones las células sedimentan sin sufrir daños.
• Choque hipotónico: Utilizando la solución de KCl 0,075 M.
• Fijación de los cromosomas de la metafase.

El choque hipotónico es una operación crítica. Tiene como objetivo eliminar los eritrocitos de la muestra. La solución de cloruro de potasio utilizada, tiene una concentración de sales menor que la que hay en el citoplasma de las células, por lo que el agua de la solución se moverá por ósmosis hacia el interior de las mismas. Los eritrocitos, que tienen una membrana más débil, se romperán y los leucocitos quedarán con un aspecto semejante a "bolsas" que llevan en su interior los cromosomas metafásicos (recordemos que la membrana nuclear desaparece al comienzo de la mitosis).

La fijación tiene como objetivos conservar la morfología de los cromosomas durante el proceso y facilitar el extendido cromosómico. Se lleva a cabo con metanol y ácido acético. El ácido acético provocará la lisis de los eritrocitos que no se hayan lisado con el choque, dando lugar a la aparición de un color marrón en el medio, consecuencia de la reducción de la hemoglobina. Uno de los fijadores más usados, es el reactivo de Carnoy, una mezcla de metanol y ácido acético en proporción 3:1.

Debes repetir el proceso de fijación seguido de centrifugación y descarte del sobrenadante varias veces (entre 4 y 5) hasta conseguir un sedimento de color blanco, donde prácticamente todo sean leucocitos.

Cuando la fijación no ha sido correcta, los cromosomas muestran en las extensiones lo que se conoce con el nombre de "halo", un material amorfo a su alrededor que da al conjunto un aspecto como de "huevo frito". Este material se tiñe en los pasos siguientes y dificulta el proceso de bandeado de los cromosomas.

Una vez realizada la fijación y el lavado de las preparaciones, se pueden guardar las células en nevera a 4ºC en fijador de Carnoy durante varios días antes de realizar las extensiones.