3.2.- Preparación de extensiones cromosómicas.

Una vez realizado el sacrificio, Susana prepara los materiales para extender. Al igual que en el día de ayer una parte muy importante del trabajo es la rotulación de tubos y pipetas Pasteur de vidrio con las que se realizarán las mezclas y resuspensiones de los cultivos. Estos materiales se identifican con el número correspondiente a cada caso.

Susana prepara los portaobjetos donde se realizará la extensión de cada uno de los casos rotulándolos con un lápiz graso. Los cultivos trabajados ayer presentan un buen aspecto. En todos ellos se puede observar un botón blanco, que indica que el proceso de sacrifico celular se ha llevado correctamente.

Antes de extender, se centrifuga de nuevo el cultivo en las mismas condiciones que el día anterior, es decir a 3000 rpm durante 10 minutos. Al finalizar la centrifugación, se decanta la mayor parte del fijador que ha estado actuando sobre las metafases durante toda la noche, dejando un volumen entre 0,5 ml y 2 ml según el tamaño del botón o sedimento celular.

En la imagen se muestran las manos del técnico realizando la resuspensión del botón celular obtenido tras la última centrifugación.
En la imagen se muestra las manos del técnico rotulando el extremo de un portaobjetos de vidrio donde va a realizar la extensión de los cultivos celulares sacrificados.

La extensión comienza inundando el portaobjetos con ácido acético al 45 % (dejando caer una serie de gotas que lo cubran por completo).

Tras esta operación se dejan caer unas 8 gotas de la suspensión celular fijada sobre el portaobjetos, colocado de la forma que se indica en la imagen (con cierta inclinación). Las gotas se dejan caer sobre el portaobjetos colocando la pipeta a cierta altura, al caer chocarán primero sobre el extremo elevado del portaobjetos y resbalarán por su superficie hasta el otro extremo. Como consecuencia del impacto la membrana plasmática de los linfocitos (que hasta ahora había permanecido intacta) se romperá, liberando los cromosomas contenidos en su interior que quedarán depositados sobre el portaobjetos, separados una cierta distancia unos de otros.

En la imagen se observa la postura adoptada por la técnico para realizar la extensión de los cultivos en los portaobjetos rotulados. La muestra se deposita sobre el portaobjetos dejándola caer desde cierta altura.

De cada uno de los casos debes extender varios portaobjetos. Una vez realizada la extensión estos se colocan en una rejilla de tinción sobre el baño a 37 ºC donde permanecerán unos minutos hasta que tanto el metanol como el ácido acético se hayan evaporado y las metafases se hayan fijado al su superficie. Tal y como puedes ver en la imagen.

La imagen muestra dos portaobjetos en los que se acaba de realizar la extensión de los cultivos de sangre periférica colocados sobre una rejilla encima de un baño termostatizado.

Inclinar suavemente una vasija sobre otra para que caiga el líquido contenido en la primera sin que salga el poso.